转印电泳中常见问题及解决方案汇总
类别一、电泳转移中出现的问题（由凝胶染色检测）
| 问题1：转移效果差--蛋白 | |
| 转移时间太短 | 增加转移时间 |
| 功率太低 | 1. 转移开始时一定检测电流。特定的电压设定会使电流过低。如果缓冲液配制不当，电导率会过低，造成没有足够的力提供给电泳槽。 2. 重新配置缓冲液或提高电压。 3. 尝试高强度转移 |
| 转移设备装配不正确，蛋白移动向错误方向 | 凝胶与膜的三明治组合顺序错误，或者三明治夹在缓冲液槽中的插入方向相反。 检查与电源连接的极性。 |
| 荷-质比不正确 | 尝试更酸或更碱的转移缓冲液以增加蛋白的迁移率。接近蛋白等电点的缓冲液pH值会使转移失败。一般建议缓冲液的pH值应低于或高于感兴趣蛋白的等电点2个pH来增加转移效率。 |
| 蛋白在凝胶中沉淀 | 尝试在缓冲液中加入SDS。SDS可以使转移效率提高，但同时也会使蛋白的结合率降低，并影响某些蛋白与抗体的反应。 |
| 电源电路不起作用，或使用不适当的电源 | 检查保险丝，确定电源的电压电流输出与所用转移设备相匹配。 |
| 缓冲液中的甲醇限制了洗脱 | 甲醇的减少造成凝胶中的蛋白质的转移效率增加，同时会降低蛋白与硝酸纤维素膜和PVDF膜的结合效率。 |
| 凝胶百分比太高 | 降低%T（总单体）或%C（交联剂）。5%C（Bis作交联剂）会产生最小的凝胶 孔径，降低此浓度会增加凝胶孔径，从而增加转移效率。 |
| 问题2：转移效果差—核酸 | |
| 凝胶百分比太高 | 1. 在聚丙烯酰胺凝胶中减少总单体百分比浓度（%T）或交联剂百分比浓度（%C）。在琼脂糖凝胶中减少琼脂糖百分比浓度（%）。 2. 转移电泳之前用0.25M稀盐酸切割DNA或稀NaOH用于RNA。 |
| 转移时间太短或功率条件太低 | 增加转移时间或者尝试使用高强度转移。 |
| DNA或RNA不能被电泳转移到硝酸纤维素膜上，因为与该膜结合所需盐浓度太高 | 使用Zeta-Probe膜替换硝酸纤维素膜 |
| 问题3：条带扭曲或丢失；扩散转移 | |
| 膜与凝胶接触不良，在印迹与凝胶之间存在气泡或多余的缓冲液 | 1. 使用试管或移液管在膜表面向不同方向小心滚动，直至膜与凝胶之间的气泡和多余的缓冲液被完全排出，即做到膜与凝胶的完全接触。 2. 在凝胶/膜的三明治中使用厚一些的滤纸。 3. 更换纤维衬垫。长时间的挤压会使衬垫变薄，不能有效地压紧膜和凝胶。 |
| 功率条件太高 | 转移开始时一定检测电流。特定的电压设定会使电流过高。如果缓冲液配制不当，电导率会过高，造成过大的功率提供给电泳槽。 |
| 膜没有被完全浸湿或者已经干燥 | 1. 硝酸纤维素膜上的白色斑点显示蛋白质不能结合的干燥区域。如果将膜沉浸在缓冲液中不能立即浸湿，可以加热蒸馏水至沸点以下，将膜全部浸泡，再以缓冲液平衡至可以使用。 2. 因为PVDF的疏水特性，PVDF膜在以水性转移缓冲液平衡之前必须先用甲醇完 全浸湿。请遵循产品指南操作。 |
| 凝胶电泳可能存在错误 | 电泳的不正常可能由于凝胶聚合不好、不合适的电泳条件、被污染的缓冲液、样品过载等因素引起。 |
| 问题4：凝胶夹图案被转移到印迹膜上 | |
| 使用了被污染的或者太薄的转移纤维衬垫 | 更换衬垫或彻底清洗被污染的衬垫。 |
| 凝胶上有过多的大量蛋白，或者缓冲液中使用了太多SDS。蛋白质可以穿透印记膜，不与其结合，并且游离在转移电泳槽中。 | 减少凝胶中的蛋白量，以及缓冲液中的SDS。增加第二张膜与多余的蛋白结合。 |
| 转移缓冲液被污染了 | 重新配置溶液 |
| 问题5：与膜的结合失败—硝酸纤维素膜 | |
| 硝酸纤维素膜需要20%的甲醇在缓冲液中来优化与蛋白质的结合 | 确认缓冲液中含有合适量的甲醇 |
| 蛋白质可能透过了硝酸纤维素膜 | 使用PVDF或尼龙（高结合容量）膜，或者减小硝酸纤维素膜的孔径（0.2μm）。降低电压或者改为标准转移（如果使用了高强度转移）。 |
| 混合的酯纤维素与蛋白质结合差 | 使用纯硝酸纤维素膜 |
| <15,000 daltons的蛋白质表现出与0.45μm硝酸纤维素膜的结合力降低，或者在分 析过程中被冲洗掉 |
1. 为增强结合的稳定性，蛋白质可以用戊二醛交联到硝酸纤维素膜上。 2. 使用具有更高结合容量的PVDF或尼龙膜。 3. 在冲洗和抗体孵育步骤中使用Tween-20作去垢剂，减少或去除强清洗条件。 |
| 转移缓冲液中的SDS会降低蛋白的结合效率 | 减少或去除缓冲液中的SDS。 |
| 印记膜可能没有被完全浸湿 | 硝酸纤维素膜上的白色斑点显示蛋白质不能结合的干燥区域。如果将膜沉浸在缓冲液中不能立即浸湿，可以加热蒸馏水至沸点以下，将膜全部浸泡，再以缓冲液平衡至可以使用。 |
| 问题6：与膜的结合失败—PVDF膜 | |
| 膜没有被完全浸湿 | 因为PVDF的疏水特性，PVDF膜在以水性转移缓冲液平衡之前必须先用甲醇完 全浸湿。请遵循产品指南操作。 |
| 操作过程中膜已经干燥 | 完全浸湿的膜具有灰色、半透明的外观。当白色斑点形成在膜表面，表示它将会干燥。由于蛋白质不会与干躁的点结合，请重新用甲醇湿润膜，并重新以转 移缓冲液平衡。 |
类别二、免疫特征检测：
| 问题1：总体背景高 | |
| 闭锁条件不合适 | 1. 封闭物必须与膜匹配。例如PVDF和尼龙膜需要更大量的封闭，一般使用脱脂干牛奶。 2. 按需要增加封闭浓度和时间。 3. 封闭物必须为纯的蛋白质。封闭物可能会被能与探针非特异结合的物质污染。 |
| 采用了效果不够的冲洗方案 | 增加冲洗的次数、持续时间或力度。包括在冲洗中渐次使用更强的去垢剂，去垢剂强度：SDS大于NP-40大于Tween-20。 |
| 印记膜被留在底物中时间太长 | 当信噪比达到可接受水平时，将印记膜从底物溶液中取出，不要显像过度，应立即把印记膜浸泡在双蒸水中终止反应。 |
| 前一步骤中存在污染，如电泳或转移时 | 1. 丢弃凝胶和缓冲液。 2. 更换或彻底清洗纤维衬垫。凝胶上有过多的大量蛋白，或者缓冲液中使用了太多SDS。蛋白质可以穿透印记膜，而不与其结合，并且游离在转移电泳槽中。减少凝胶中蛋白的量或缓冲液中SDS含量。增加第二张膜与多余的蛋白结合。 |
| 一抗或二抗的浓度太高 | 增加抗体的稀释度。做斑点-印记试验优化工作浓度。 |
| 孵育盘被污染 | 清洗托盘或使用一次性托盘。 |
| 问题2：结合蛋白与探针没有特异反应 | |
| 一抗或二抗被非特异性或交叉反应IgG污染 | 使用纯化的IgG作一抗和亲和纯化的印记级二抗。 |
| 单克隆抗体可能非特异性的与SDS变性蛋白反应 | 1. 比较其他单克隆抗体或多克隆抗体 2. 用非变性蛋白作印记 |
| 由离子组合引起无意义相互作用，例如：抗生素蛋白、糖蛋白等可能会与膜上的较酸性的蛋白结合 | 增加孵育缓冲液的离子强度。增加冲洗的次数、持续时间和力度。包括在冲洗中渐次使用更强的去垢剂，去垢剂强度：SDS大于NP-40大于Tween-20。在抗体稀释液中包含Tween-20来减少非特异结合。 |
| 问题3：没反应或信号弱 | |
| 样品量不够 | 增加蛋白的上样量。上样之前样品可能需要浓缩。或使用更灵敏的检测方法。 |
| 结合到膜上的抗原不够 | 转移后将凝胶染色或使用预染或万花筒标准品评估转移效率。 |
| 一抗或二抗失活或者未饱和 | 1. 试剂储存条件须满足要求。避免反复冻融、细菌污染和热失活。 2. 去垢剂会影响某些抗体活性，除闭锁后的冲洗之外，在体系中去除去垢剂。 3. 如果抗体效价太低，用斑点-印记实验优化其浓度。 4. 增加抗体孵育时间。 |
| 酶复合物失活或者未饱和 | 1. 测定试剂活性（见说明）： 2. 试剂储存条件须满足要求。避免反复冻融、细菌污染和热失活。 3. 叠氮化钠是有效的辣根过氧化物酶抑制剂。使用工汞硫代水杨酸钠（Thimerosal）作抑菌剂。 4. 水不纯也可引起酶失活，全部使用蒸馏去离子水。 5. 如果酶复合物浓度太低，使用斑点-印记实验优化其浓度。 |
| 显色试剂失活 | 测试试剂活性（见说明），如果需要，重新配置。 |
| 说明：测试试剂活性 | 1. 显色溶液活性测试 混合1.0ml显色溶液和10μl第二抗体复合物，显色反应立刻进行。如果几分钟内颜色没有显现出来，则说明显色试剂失活，需配置新溶液重做显色实验。 |
| 2. 辅酶溶液活性测试 取1.0ml上述测试过的显色溶液，与1.0ml 1:3000稀释的辅酶溶液混合。15分钟内应该有淡蓝色亮光出现。如果25分钟内亮光还没出现，说明辅酶溶液有问题。使用新鲜配置的辅酶溶液重复实验步骤。 |
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| 3. 一抗溶液活性测试 使用ELISA、放射免疫检测、双向免疫扩散或沉淀法测定抗原抗体反应。如果可能，可使用几种不同稀释度的一抗溶液重复实验步骤。 |
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类别三、总蛋白检测
| 问题1：凝胶夹图案被转移到印迹膜上 | |
| 使用了被污染的或者太薄的转移纤维衬垫 | 更换衬垫或彻底清洗被污染的衬垫。 |
| 凝胶上有过多的大量蛋白，或者缓冲液中使用了太多SDS。蛋白质可以穿透印记膜，不与其结合，并且游离在转移电泳槽中。 | 减少凝胶中的蛋白量，以及缓冲液中的SDS。增加第二张膜与多余的蛋白结合。 |
| 转移缓冲液被污染了 | 重新配置溶液 |
| 问题2：与膜的结合失败—硝酸纤维素膜 | |
| 硝酸纤维素膜需要20%的甲醇在缓冲液中来优化与蛋白质的结合 | 确认缓冲液中含有合适量的甲醇 |
| 蛋白质可能透过了硝酸纤维素膜 | 使用PVDF或尼龙（高结合容量）膜，或者减小硝酸纤维素膜的孔径（0.2μm）。降低电压或者改为标准转移（如果使用了高强度转移）。 |
| 混合的酯纤维素与蛋白质结合差 | 使用纯硝酸纤维素膜 |
| <15,000 daltons的蛋白质表现出与0.45μm硝酸纤维素膜的结合力降低，或者在分 析过程中被冲洗掉 |
1. 为增强结合的稳定性，蛋白质可以用戊二醛交联到硝酸纤维素膜上。 2. 使用具有更高结合容量的PVDF或尼龙膜。 3. 在冲洗和抗体孵育步骤中使用Tween-20作去垢剂，减少或去除强清洗条件。 |
| 转移缓冲液中的SDS会降低蛋白的结合效率 | 减少或去除缓冲液中的SDS。 |
| 印记膜可能没有被完全浸湿 | 硝酸纤维素膜上的白色斑点显示蛋白质不能结合的干燥区域。如果将膜沉浸在缓冲液中不能立即浸湿，可以加热蒸馏水至沸点以下，将膜全部浸泡，再以缓冲液平衡至可以使用。 |
| 问题3：与膜的结合失败—PVDF膜 | |
| 膜没有被完全浸湿 | 因为PVDF的疏水特性，PVDF膜在以水性转移缓冲液平衡之前必须先用甲醇完全浸湿。请遵循产品指南操作。 |
| 操作过程中膜已经干燥 | 完全浸湿的膜具有灰色、半透明的外观。当白色斑点形成在膜表面，表示它将会干燥。由于蛋白质不会与干躁的点结合，请重新用甲醇湿润膜，并重新以转移缓冲液平衡。 |
2024年6月28日 14:15
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