内参是一种在样品中高度表达的蛋白质，在WB实验中被用作阳性对照。使用内参的最主要原因是确保数据和结论的可靠性，帮助证明目的表达差异是由实验条件本身所引起的，而不是由于样品上样量或转膜的变化造成的。如果存在上样不均一或转膜不一致，则无法知道你的实验结果是否支持或否认你的假设。
在Western Blot实验中，我们使用内参其实就是使用与内参对应的抗体来检测内参的表达量。由于内参在不同组织和细胞中的表达量相对稳定，通过检测每个样品内参的表达量，我们可以校正上样误差，从而获得更可靠的半定量结果。使用内参还可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全，并检查该实验中的显色或发光体系是否正常。通过选择合适的内参，可以将这些样本之间的差异消除或最小化，减少实验误差，提高结果的可靠性和可重复性。因此，选择合适的内参是Western Blot实验的关键步骤之一。
● 稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别；
● 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响；
● 不同样本来源选择不同，具体参照文献，如哺乳动物的组织或细胞，主要以β-actin，GAPDH，β- tubulin，PCNA等为代表。如是植物样本，主要以 actin、Rubisco 为代表；
● 表达位置要区分，不同细胞器选择不同的内参蛋白。
怎样选择合适内参
样本种属来源
根据所做的样本的种属确定，哺乳动物一般β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等；植物样本一般选择Plant actin、Rubisco等；其他来源样本应参考文献报道选合适蛋白作为内参。
蛋白表达位置
根据研究的对象所在细胞中的位置选择相应内参。一般情况下，选择β-actin和GAPDH作为总蛋白的内参就可以满足要求。然而，研究细胞质、细胞核、细胞膜等不同位置的蛋白样品，我们需要选择相应亚细胞器的内参，以确保实验结果具有科学性和可靠性。常用内参抗体分子量及其定位情况如下：
a.胞浆和全细胞蛋白：β-actin（43kDa）、GAPDH（37kDa）、Tubulin（55kDa）等；
b.核蛋白：PCNA（29kDa）、Histone H3（17kDa）、Lamin B (66kDa) 等；
c.胞膜蛋白：Na+/K+-ATPase（100kDa）等；
d.线粒体蛋白：COX IV（17kDa）、VDAC1（30kDa）等。
在选择内参抗体时应考虑目的蛋白分子量大小。通常要求目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上，以确保两种蛋白质在检测过程中不会重叠和实验结果的准确性。例如，若检测的目的蛋白分子量为45kDa，则不宜选择分子量为42kDa的β-actin作为内参，应考虑选择分子量为36kDa的GAPDH作为内参。
在实际的实验环境中，处理条件可能会影响一些内参的表达，因此需要考虑研究的信号通路是否会对内参的表达产生影响。例如，在糖代谢的研究中，不能使用GAPDH作为内参，因为GAPDH是参与糖酵解过程中的酶，在衰老的骨骼肌中，缺氧等条件会改变GAPDH的表达；在凋亡实验时，Lamin等也不适合作为内参；在加入抗癌和抗真菌药物时，Tubulin的表达易受影响，不适合作为内参等。因此，在设计实验方案的时候应考虑这些因素并参考相关文献，在实验过程中，还需要留意内参表达是否出现异常等因素的考虑。
如脑组织的 tubulin 的表达会高一些（因为神经细胞的轴突和树突都由 tubulin 维持结构），而 actin 的表达量可能会低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化，这种情况可以选择GAPDH。
