磷酸化蛋白样品处理与Western Blot的一些问题

磷酸化蛋白样品处理

迅速取样与低温操作：磷酸化反应迅速，因此取样需迅速，样品需新鲜。所有操作最好在冰上进行，以缩短处理时间。处理细胞时，要使用4℃预冷的PBS洗涤细胞，对于组织则采用液氮研磨，研磨器具需预冷。

裂解液配制：提取磷酸化蛋白裂解液需新鲜配制，需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（如okadaic acid, NaF）。另外需要根据特定磷酸化位点（如酪氨酸）添加特定抑制剂（如sodium vanidate）。

样品保存：提取后立即变性，并于-80℃分装保存，避免反复冻溶导致磷酸基团降解。

Western Blot操作要点

上样量：磷酸化蛋白表达丰度低，一般只有总蛋白量的10%，需确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。

防止脱磷酸化：在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂（如Na3VO4）。

抗体选择：磷酸化抗体的质量至关重要，选择信誉好的厂商。因为磷酸化蛋白丰度低，一抗最好4℃过夜，保证充分结合，二抗室温孵育1小时。

洗涤与孵育：洗涤时摇床转速不宜过快，时间不宜过长，每次5分钟，共3次。避免多张膜叠在一起洗涤。

Western Blot时背景与条带问题：

压片：时间需适当，避免背景过深或过浅。对比TBST洗涤的膜，密理博（millipore）最近的说明书推荐使用双蒸水洗涤，可有效降低背景。磷酸化蛋白WB时，除了目的条带，常常出现非特异性条带，因些，压片后要事实上要根据Markers比对条带分子量。

总蛋白表达量：研究磷酸化情况后，常常需要研究对应的总蛋白表达量。推荐使用strip液洗去已结合抗体，再用同一张膜压总蛋白和内标。